随着我国畜禽养殖业的迅猛发展，在带动农村经济发展的同时，也带来了严重的环境污染问题。养殖废水净化的瓶颈即为大量高浓度NH4+-N的去除，因高浓度NH4+-N会对植物产生毒害作用。目前,去除猪场废水NH4+-N的方法有很多，其中选择水生植物构建人工湿地是修复和净化污染水体的一种重要手段，因其具有高效、低成本、低耗能，可循环等优点，同时可以增加水体的生态服务效益和经济效益而备受青睐。

绿狐尾藻(Myriophyllum aquaticum)，别称绿羽毛草，为挺水或沉水植物，原产于南美洲，属于小二仙草科狐尾藻属，作为景观植物引入我国已有200多年，主要生长在稻田、溪流、池塘区。Best等对受美国衣阿华陆军弹药厂爆炸物所污染的地表水进行水生和湿地植物修复的筛选与应用中发现，绿狐尾藻的处理效果最佳。绿狐尾藻沉水的部分含有40%~89%的总氮(TN)，具有储存N的能力，而且叶片含有更多的N，其对NH4+-N有很强的偏好性和耐受力。 Souza等利用绿狐尾藻作为生物调节器处理污染水体的研究表明，30 d后,污染物最大的去除率表现为：BOD 75.4%，COD 67.4%，NH4+-N 98.6%，TN 88.3%，总磷(TP)93.6%。近5年，中国科学院亚热带所利用绿狐尾藻构建的人工湿地系统，研究表明其对不同浓度的TN和NH4+-N的平均去除率分别可达到90%和84%以上;绿狐尾藻作为生物调节器改变了水体中微生物的生长环境,影响硝化与反硝化微生物丰度、多样性与群落分布,加速了NH4+-N和TN的去除。

绿狐尾藻在养殖废水处理中表现出对NH4+-N的高吸收特点，但其对高浓度NH4+-N耐受的生理特征及养分吸收累积的特点研究尚显不足。因此，本研究分析不同高浓度NH4+-N处理对绿狐尾藻生理特性及N、P养分吸收的影响，以初步探究绿狐尾藻对养殖废水N消纳和去除的作用机制，以便更好利用绿狐尾藻进行环境治理提供有价值的资料，以期为实现绿狐尾藻人工湿地系统对污染物的减量化、无害化和资源化利用提供理论和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验取材与培养

试验所用材料均采自中国科学院长沙农业环境观测研究站.将从野外基地取得的20~30 cm新鲜植物样,先用自来水清洗,然后用蒸馏水清洗,最后将其幼苗在Hoagland营养液(表1)中驯化培养10 d左右,每4 d更换营养液,调节营养液的pH值为6.8~7.0.Hoagland营养液的配方及成分

试验前,选择生长健壮大小一致的绿狐尾藻,剪其株长大约为12 cm,用超纯水冲洗干净,称其鲜重,然后转入用超纯水配置的0.1 mmol·L-1的硫酸钙溶液中(无其它离子)饥饿2 d,以排除自由空间中残留的N素对试验的影响.大部分废水的NH4+浓度在70 mg·L-1,且已有报道绿狐尾藻湿地系统在200 mg·L-1的NH4+废水中可以有良好的净水效果,故设置70 mg·L-1的NH4+浓度为对照,和两个高NH4+水平：210 mg·L-1和420 mg·L-1.培养液仍采用Hoagland营养液(除N营养外),每箱8 L,每箱20穴,每穴3株, 3次重复.生长溶液每天调节pH为6.8~7.0,每4 d更新营养液。

1.2 测定指标与方法

培养1、3、7、10、14、21 d,称取鲜重和测量地上部高度,以及植物的TN和TP;于7、10、14、21 d测量根长.收获(21 d)时,测定叶、茎叶绿素和可溶性糖含量,以及组织的丙二醛(MAD)含量。

按照公式(1)~(4)分别计算相对生物量(relative biomass, RB, g),相对生长速率[biomass relative growth rate, BRGR, g·(g·d)-1],相对茎高(relative shoot height, RSH, cm)以及相对茎生长速率(shoot relative growth rate, SRGR, cm·d-1).叶绿素a(Ca)和叶绿素b(Cb)的含量,采用95%乙醇提取,分光光度法测定;总叶绿素(Ca+b)的含量等于叶绿素a与叶绿素b之和;可溶性糖采用蒽酮比色法测定, MAD采用硫代巴比妥法测定.用浓硫酸-过氧化氢消煮,测植株TN和TP式中, W0、W1和WN分别指起始、第1 d和第N d采样时测定的生物量(g), SH0、SH1和SHN分别指起始、第1 d和第N d采样时测定的茎高(cm), t1和tN分别指第1 d和第N d采样的天数(d)。

1.3 数据分析

数据均为3次重复的平均值,误差线均为标准误.数据统计利用SAS软件,进行方差分析和Fisher's显著性检验(LSD),比较不同处理间在P < 0.05的显著性水平.采用Microsoft Office Excel 2007(Microsoft, Redmond, WA, USA)和Sigmaplot 10.0(Systat Software, Inc., Chicago, IL, USA)软件进行数据分析和作图。

2. 结果与分析

2.1 生长特征

70 mg·L-1的高NH4+处理下,绿狐尾藻生长健壮(图1),茎高和生物量随着时间的延长在直线增加[图2(a)和(b)],至21 d时,绿狐尾藻的相对茎高和生物量分别达到40.56 cm和17.82 g·穴-1,其茎和生物量的生长速率分别是1.94 cm·d-1和0.11 g·(g·d)-1(图3).与70 mg·L-1的NH4+处理相比,当NH4+水平增加到210 mg·L-1时,相对茎高和生物量略有降低,它们的生长速率与其无显著差异(图3);而当NH4+水平达到420 mg·L-1时,茎高和生物量生长速率均显著降低,仅为对照的27.4%和17.9%,且10 d时即达到最高值,之后则表现出生长不良甚至死亡的现象[].

绿狐尾藻根系的生长亦随着NH4+水平的升高而被显著抑制[图2(c)].移栽至10 d时,根系的生长达到最长,与70 mg·L-1的NH4+处理相比, 210 mg·L-1和420 mg·L-1的NH4+处理下,根长分别降低了21.1%和44.7%. 10 d后, 70 mg·L-1和210 mg·L-1的NH4+处理下,根系已基本停止生长,而420 mg·L-1的高NH4+处理下,根系变黑腐烂(图1)

2.2 叶绿素含量

高NH4+处理显著影响绿狐尾藻叶绿素的含量(图4).与70 mg·L-1的NH4+处理相比,当NH4+水平提高到210 mg·L-1或420 mg·L-1时,叶片叶绿素a和b的含量显著下降,且叶绿素a的含量仅是对照的50%左右[图4(a)].随着NH4+水平的增加,叶片叶绿素a与b的比值在降低, 70、210和420 mg·L-1处理下,其比值分别是2.9、2.6和1.9.叶片总叶绿素含量与叶绿素a的变化趋势相似,与70 mg·L-1的NH4+处理相比, 210 mg·L-1和420 mg·L-1处理下,叶片叶绿素含量显著下降,分别下降了39.7%和36.3%,而它们之间无显著差异.

茎的总叶绿素显著低于叶片,仅为叶片的4%~10%. 70 mg·L-1 NH4+处理下,茎叶绿素的含量为0.12 mg·g-1,当NH4+水平提高到210 mg·L-1时,茎的总叶绿素含量显著增加,增加了40%;而当NH4+水平增加到420 mg·L-1时,茎的总叶绿素含量显著降低,降低了30%[图4(b)].相应地,与70 mg·L-1 NH4+处理相比, 210 mg·L-1 NH4+处理下,叶绿素a及叶绿素b显著提高,分别提高了26.5%和66%;而达到420 mg·L-1 NH4+处理时,叶绿素a与b显著降低,分别降低了42.4%和5.1%[图4(b)].茎中叶绿素a与叶绿素b的比值亦随着NH4+水平的提高而降低, 70、210和420 mg·L-1处理下,其比值分别是2.0、1.5和1.2.

2.3 可溶性糖含量

所示, 70 mg·L-1的NH4+处理时,可溶性糖含量在茎显著比叶中高(P < 0.05),高42.6%.与70 mg·L-1 NH4+处理相比,当NH4+水平提高到210 mg·L-1时,叶、茎的可溶性糖含量显著降低(P < 0.05),分别降低了41.8%和62.7%;而当NH4+水平达到420 mg·L-1时,叶中的可溶性糖含量显著升高(P < 0.05),增加了47.8%,而茎中的可溶性糖含量显著下降,降低了63.9%.

不同高铵水平下绿狐尾藻的叶片和茎可溶性糖含量

2.4 丙二醛(MAD)的含量

随着NH4+水平的增加,丙二醛含量逐渐增加(图6). 70 mg·L-1的NH4+处理下,丙二醛的质量摩尔浓度最低为11.5 nmol·g-1.当NH4+水平增加到210 mg·L-1和420 mg·L-1时,丙二醛的含量分别增加了1倍和2倍,达到显著性差异(P < 0.05).说明随着NH4+水平的提高,绿狐尾藻受到NH4+胁迫的程度越来越严重.

不同高铵水平下绿狐尾藻组织内丙二醛含量

2.5 氮、磷吸收特征

如图7(a)所示,随着时间的延长,植物中N含量亦随着NH4+-N浓度的提高先增加而后降低, TN的变幅在30.7~53.4 mg·g-1之间. 70 mg·L-1NH4+-N处理下,绿狐尾藻组织中TN含量的峰值(40.5 mg·g-1)出现在第10 d,比第1 d增加了14%.当NH4+-N水平提高到210 mg·L-1时,培养7 d之内,组织内TN含量与对照无显著差异;随着时间的延长,组织内TN的含量显著高于对照,峰值(45.0 mg·g-1)出现在第14 d,比对照峰值高11.1%.当NH4+-N水平达到420 mg·L-1时,组织内TN的含量显著高于前两个高NH4+-N水平处理,峰值(53.4 mg·g-1)亦出现在第14 d,比对照峰值高31.8%.至21 d时,由于植物生物量的增加导致的稀释效应, TN的含量反而有所下降,甚至低于初始TN含量.如图7(b)所示,不同高NH4+处理下,随培养时间的延长,绿狐尾藻组织中TP的含量逐渐增加, TP的变幅在3.8~7.7 mg·g-1之间.短时间内差异不明显. 70 mg·L-1NH4+-N处理下,至收获(21 d)时,绿狐藻组织中TP达到最高为7.7 mg·g-1,比第1 d时增加了近1倍.当NH4+-N水平增加到210 mg·L-1和420 mg·L-1, TP的含量在收获时分别比第1 d增加了47.7%和54.9%,但与70 mg·L-1的处理相比,分别显著降低了38.6%和27.0%,说明高NH4+-N胁迫可能抑制P的吸收。

不同高NH4+-N水平下绿狐尾藻的N、P含量的变化特性

3 讨论

水生植物不仅自身可以同化吸收大量的N、P等物质,而且可以为微生物提供氧气和栖息场所,促进微生物对水质的去除,所以水生植物的生长状况与其湿地系统污染物的去除效率密切相关.众所周知, NH4+-N是植物可利用的N源,但其对植物有高毒性,在很低的浓度,比如外部质量浓度高于2 mg·L-1就有可能产生毒害,影响植物的生长发育.植物体内叶绿素、碳水化合物含量以及MAD的累积量可以反映植物受胁迫和程度.本研究中, MAD的含量随NH4+-N浓度的增加而显著增加,表明绿狐尾藻受NH4+-N的胁迫程度亦在逐渐增大.但在70~210 mg·L-1高水平NH4+-N处理下,绿狐尾藻茎高和净生物量都随时间的延长在直线增加,叶绿素和可溶性糖含量较高,说明其光合能力也较强;而当NH4+-N水平达到420 mg·L-1时,光合能力下降,叶绿素和可溶性糖含量均降低,植物生长受阻甚至死亡.已有研究报道,水生植物在NH4+-N质量浓度1.5~28 mg·L-1中生长4~8 d,可以检测到NH4+-N的毒性.耐NH4+-N的水生植物大藨草(Actinoscirpus grossus)在35 mg·L-1的高NH4+-N处理下生长最好,当NH4+-N水平提高到140~210 mg·L-1时,亦会受到NH4+-N的胁迫,根系生长不良,光合效率下降.本研究表明,绿狐尾藻在210 mg·L-1的高NH4+-N水平,受到一定胁迫,但仍可以正常生长,而且光合能力也很强,说明绿狐尾藻在高NH4+-N条件下仍有很高的生产力,很可能是一种氨超耐受植物。

绿狐尾藻对N, P的高效吸收能力是绿狐尾藻湿地系统对污染物净化能力的重要指标之一.鲁静等的研究表明,洱海流域44种湿地植物的TN和TP含量平均为15.7 mg·g-1和3.3 mg·g-1;金树权等比较研究10种水生植物,发现它们N、P含量的变化范围分别是13.67~26.38 mg·g-1和1.16~3.50 mg·g-1.本研究中,在不同高浓度NH4+-N处理下,绿狐尾藻N和P的含量变化范围为30.7~53.4 mg·g-1和3.8~7.7 mg·g-1,比已有报道的水生植物N、P含量均高.已有的研究中N的处理浓度相对比较低,可能主要因为其在超过28 mg·L-1的高NH4+-N介质中,会受到氨毒害而无法正常生长,从而影响N、P的吸收.绿狐尾藻不仅能在超高NH4+-N的条件下正常生长,而且可以吸收大量的N和P,表明其在高NH4+-N的废水中对N、P去除作将会有极大的贡献.从图8可以看出，当NH4+水平高达210 mg·L-1和420 mg·L-1时，在绿狐尾藻干物质的量在直线下降的情况下，其对N、P的累积量虽也显著下降，但比生物量下降的速度慢.因此,绿狐尾藻生态湿地系统高效净化高NH4+-N的废水时,其质量浓度的适应范围应在420 mg·L-1以下。

4 结论

(1) 绿狐尾藻可能是一种超耐氨的水生植物,对NH4+-N的耐性可以达到210 mg·L-1,此条件下,茎和生长量的增长速率分别是1.83 cm·d-1和0.11 g·(g-1·d-1),与70 mg·L-1的高NH4+处理无显著差异。

(2) 绿狐尾藻对N和P有相当高的吸收能力,在70~420 mg·L-1的高NH4+处理下,植株TN变幅在30.7~53.4 mg·g-1, TP的变幅在3.7~7.7 mg·L-1。

(3) 在处理高NH4+-N废水的生态湿地系统的构建中,绿狐尾藻可作为一种良好的候选水生植物。